Forschungsexom

Das Exom repräsentiert die Gesamtheit aller bekannten kodierenden Exons des menschlichen Genoms. Obwohl es nur ca. 1-2 % des Genoms umfasst, liegen dort Schätzungen zufolge 85 % aller bekannten krankheitsverursachenden Mutationen. Daher ist es häufig sinnvoll, gezielt das Exom zu untersuchen. Die Anwendungsbereiche und Zielsetzungen für eine Exom-Sequenzierung in der wissenschaftlichen Anwendung sind sehr vielfältig und reichen von der Populationsgenetik, über die Erforschung verschiedener genetisch verursachter Krankheitsbilder bis hin zur Tumordiagnostik.

CeGaT weist eine sehr große Expertise im Bereich der Exom-Sequenzierung auf und bietet Ihnen von der DNA-Extraktion (aus nahezu jeder Quelle) bis hin zur Datenanalyse einen umfassenden Service.

Das Protokoll kann dabei an die Voraussetzungen Ihrer Proben angepasst werden. So bieten wir auf Anfrage für gering konzentrierte Proben ein Low-Input-Protokoll an, bei dem bereits 200 ng DNA als Einsatzmenge genügen. Für den Einsatz von DNA, die aus FFPE-Gewebe isoliert wurde, haben wir ein angepasstes Protokoll entwickelt, das die spezielle Beschaffenheit stark fragmentierter DNA berücksichtigt.

Bei der Datenauswertung profitieren Sie von unserer großen humangenetischen Erfahrung bzw. unserer Expertise im Bereich Tumordiagnostik:

  • Im Falle der Einsendung von Proben von mehreren Familienmitgliedern führen wir eine stammbaumabhängige Filterung für verschiedene Vererbungsmodelle durch. Hierzu zählen beispielsweise die Identifizierung von de novo Mutation aus einem Trio (=Eltern und betroffenes Kind), Identifizierung compound-heterozygoter Varianten aus einem Trio oder die Identifizierung von gemeinsamen Varianten für verschiedene betroffene Familienmitglieder.
  • Bei Einsendung von Tumorgewebe und entsprechendem Normalgewebe führen wir eine vergleichende Tumor-Normalgewebe-Analyse durch und identifizieren für Sie gezielt somatische Mutationen im Tumorgewebe. Dabei ist ein Tumorgehalt von nur 20 % ausreichend, wobei ein höherer Tumorgehalt zu einer besseren Detektierbarkeit subklonaler Mutationen führt.

Bei der Durchführung Ihres Sequenzierauftrages stehen für uns die hohe Qualität und Zuverlässigkeit der gelieferten Ergebnisse im Vordergrund. Jedes Projekt wird von einem Wissenschaftler geleitet und von einem Projektmanager betreut, der während der gesamten Projektphase Ihr Ansprechpartner ist. Bei Projektabschluss erhalten Sie einen detaillierten Projektbericht mit Informationen zum Eingangs-QC, wichtigen Laborparametern und bioinformatischen Auswertungen und Erklärungen.

Technische Informationen

Technische Durchführung

Die Anreicherung der kodierenden Bereiche sowie der angrenzenden Intronbereiche (+/-10 bp) erfolgt mit der in-Solution Technologie von Agilent (SureSelectXT Human All Exon V6), wodurch eine gleichmäßige Readverteilung garantiert ist.

Die Hochdurchsatz-Sequenzierung wird auf der HiSeq Plattform von Illumina mit 2×100 bp durchgeführt.

Die Sequenziertiefe kann individuell an Kundenwünsche angepasst werden. Zur Orientierung bieten wir zwei verschiedene Standard-Sequenziertiefen (10 – 12 Gigabasen bzw. 18 – 20 Gigabasen) an. Die untenstehende Tabelle zeigt, welche durchschnittliche Coverage sich bei Einsendung hochmolekularer DNA daraus ergibt.

Sequenziervolumen (Gigabasen) Durchschnittliche Coverage Cov <10 (bp, %) Cov <30 (bp, %)
10 – 12 GB 100 – 120 x 2,5 % ~10 %
18 – 20 GB 200 – 220 x 1,6 % ~ 4,5 %
Tabelle 1: Berechnung der durchschnittlich zu erwartenden Coverage bei Einsendung von hochmolekularer DNA. Bei Einsendung stark fragmentierter niedrigmolekularer DNA (beispielsweise DNA aus FFPE-Gewebe) sind bei gleicher Sequenziertiefe niedrigere Coverage-Werte zu erwarten. Die Spalten Cov <10 (bp, %) bzw. Cov <30 (bp, %) geben an, welcher Prozentsatz des sequenzierten Bereichs mit einer Coverage <10 bzw. <30 abgedeckt sein wird.
Bioinformatik

Wir bereiten Ihnen die Sequenzierdaten so auf, dass Sie direkt mit der genetischen Auswertung Ihrer Proben beginnen können. Das beinhaltet das Alignment der Reads gegen das Referenzgenom, die Detektion (Calling) von Varianten sowie die Annotation der erhaltenen Variantenlisten anhand externer Datenbanken. Die so annotierten Listen können Sie direkt (z.B. in Microsoft Excel) öffnen, filtern, sortieren und weiter auswerten.

Im Falle der Einsendung von Proben mehrerer Familienmitglieder führen wir auf Wunsch eine Filterung für verschiedene Vererbungsmodelle durch. Die bestmögliche Filterungsstrategie wird zu Beginn des Projektes besprochen.

Sollten Sie darüber hinausgehende Analysen durchführen wollen, stehen Ihnen für jeden Zwischenschritt der Analyse ebenfalls Daten zur Verfügung (Rohdaten, alignierte Reads, Variant Calls). Damit können z.B. web-basierte Auswertungsprogramme, wie beispielsweise Ingenuity Variant Analysis verwenden.

Lieferumfang

Unser Lieferumfang umfasst folgende Leistungen:

  • Rohdaten im FastQ-Format (*fastq.gz)
    Sie erhalten die Sequenzdaten, wie sie vom Sequenzer geliefert werden. Technische Adaptersequenzen haben wir bereits für Sie entfernt.
  • Alignierte Reads im BAM-Format (*bam)
    Die Reads werden mit Burrows Wheeler Aligner (bwa v.0.7.2) gegen das menschliche Genom (hg19) aligniert. Wir entfernen Sequenzen, die als PCR-Duplikate die Analyse verfälschen können, ebenso Sequenzen, die nicht eindeutig einer einzigen genomischen Region zugeordnet werden können.
  • Variantenlisten (*.vcf)
    Auf Basis der alignierten Reads ermitteln wir Unterschiede im Genom Ihrer Probe verglichen mit dem Referenzgenom. Wir verwenden sehr sensitive Einstellungen, um das Risiko von falsch negativen Varianten zu minimieren. Dies führt zu einer relativ großen Zahl an detektierten Varianten, die Sie in späteren Analyseschritten je nach den Anforderungen Ihrer Analyse herausfiltern können.
  • Annotierte Variantenlisten (*.tsv)
    Die detektierten Varianten werden mit verschiedenen Datenbanken verknüpft, um die Interpretation (z.B. Priorisierung) zu ermöglichen. Sie erhalten Informationen über die chromosomale Position der gefundenen Variante, eine funktionale Klassifizierung der Variante, Position und Sequenzveränderung in Bezug auf das am stärksten betroffene Transkript sowie Informationen über die Häufigkeit der Variante in der Gesamtbevölkerung. Positionsangaben in HGVS-Nomenklatur erlauben eine direkte Übernahme der Information z.B. für Publikationen.
  • Detaillierter Projektbericht
    Unser Projektbericht enthält Informationen zu den Ergebnissen der Qualitätsprüfungen beim Probeneingang, zu den im Labor verwendeten Kits und Protokollen, sowie zu Programmversionen in der Datenprozessierung. Darüber hinaus erhalten Sie Statistiken über die aufgefundenen Varianten.
  • Optional: Im Falle der Einsendung von Proben mehrerer Familienmitglieder führen wir eine Filterung für verschiedene Vererbungsmodelle durch (z.B. Identifizierung von de novo Mutation aus einem Trio, Identifizierung compound-heterozygoter Varianten aus einem Trio, Identifizierung von gemeinsamen Varianten für verschiedene Familienmitglieder).
Weitere Informationen

Datenversand: Der Versand der Daten erfolgt auf Festplatte per Post.

Bearbeitungszeit: 6-8 Wochen

Probenaufbewahrung: Die verbleibende DNA wird für drei Monate nach Datenübergabe aufbewahrt.

Starten Sie Ihr Projekt jetzt

Sprechen Sie uns an, wir entwickeln auch für Ihr Projekt gern ein Konzept.

Gegebenenfalls können Sie uns bereits Informationen zum Probenmaterial, der Probenanzahl und der gewünschten Sequenziertiefe geben.

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