Ermöglicht eine zielgerichtete Behandlung Ihrer Patientinnen und Patienten

Unser umfassender mediznischer Bericht umfasst:

• Varianten mit therapeutischer Relevanz – weitere Informationen
• Behandlungsmöglichkeiten basierend auf somatischen Varianten
• Analyse der Tumormutationslast (TMB), der Mikrosatelliteninstabilität (MSI) und Virusinfektionen (HPV, EBV – weitere Informationen
• Berechnung des HRD-Scores – weitere Informationen
• Illustration krebsrelevanter Signalwege – weitere Informationen
• Erkennung von therapierelevanten Kopienzahl-Varianten (copy number variants, CNV) – weitere Informationen
• Vergleich zwischen Tumor und Normalgewebe – weitere Informationen
• Auflistung aller in Frage kommenden Medikamente mit EMA und/oder FDA-Zulassung für deren Anwendungsoption entsprechende Biomarker im Tumor nachgewiesen werden konnten.
• Übersichtliche Informationen zu Zulassungskriterien, Restriktionen und Wirkstoffkombinationen laut EMA/FDA
• Bestimmung von pharmakogenetisch relevanten Keimbahnvarianten, die die Verstoffwechselung bestimmter Tumormedikamente oder Narkosemittel beeinflussen
• Erfassung von Hinweisen auf CHIP (Klonale Hämatopoese von unbestimmtem Potential)

Zusätzliche Dienstleistungen:

• RNA-basierte Analyse von Fusionstranskripten – weitere Informationen

Normales Gewebe:

• 1-2 ml EDTA-Blut oder
• Genomische DNA (1-2 µg)

Tumorgewebe: (Tumorgehalt mindestens 20%)

• FFPE-Tumorblock (min. Gewebegröße 5x5x5 mm) oder
• FFPE-Tumorgewebe-Objektträger (min. 10 Schnitte 4-10 µm, Gewebegröße 5×5 mm) oder
• Genomische DNA (> 200 ng) oder
• frisch gefrorenes Tumorgewebe oder
• 3x 10 ml cfDNA-Röhrchen für Flüssigbiopsie

Andere Probenmaterialien sind auf Anfrage möglich. Bitte beachten Sie: Bei unzureichender Probenqualität oder Tumorgehalt kann die Analyse fehlschlagen. Wenn Sie mehr als eine Option für Tumorproben haben, wenden Sie sich bitte an uns (tumor@cegat.de). Wir unterstützen Sie gerne bei der Auswahl der optimalen Probe für Ihre Patientinnen und Patienten. Für höchste Genauigkeit benötigen wir Tumor- und Normalgewebe für unser somatisches Tumordiagnostik-Panel.

Das einzig valide Vorgehen zur korrekten Ermittlung somatischer Varianten

Für eine genaue molekulargenetische Interpretation des Tumors ist ein präzises Verständnis der Genetik erforderlich. In der Tumordiagnostik müssen Varianten unterschieden und verglichen werden, die auf den Tumor beschränkt sind (somatische Varianten) oder die auch im gesunden Gewebe vorhanden sind (Keimbahnvarianten).

Die einzig valide Methode, Varianten im gesunden Gewebe zu bestimmen, ist die Sequenzierung des passenden Normalgewebes zusammen mit dem Tumorgewebe. Methoden, die versuchen, die Normalgewebesequenzierung durch bioinformatische Ansätze zu ersetzen, können nicht klar zwischen Keimbahn- und somatischen Varianten unterscheiden, insbesondere wenn der Tumorgehalt der Probe hoch ist (Jones et al., 2015; Sun et al., 2018)

Aus diesem Grund sequenzieren wir immer sowohl DNA aus dem Tumor als auch aus normalem Gewebe (meist Blut). Die Sequenzierungsdaten beider Gewebe werden verglichen und so die tatsächlich somatischen Varianten bestimmt.

Um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, ist der Vergleich von Tumoren mit entsprechendem Normalgewebe unerlässlich. Diagnostische Tests, die keine Analyse von Tumoren und dazu passendem Normalgewebe durchführen, liefern in der Regel ungenaue Ergebnisse. Wir bei CeGaT sequenzieren für unsere CancerPrecision® Diagnostik immer Tumorgewebe und das entsprechende Normalgewebe.

Wegweiser für potenziell wirksame Medikamente

Die einzelnen therapierelevanten Veränderungen werden für jedes Gen detailliert dargestellt und die sich daraus ergebenden therapeutischen Optionen, einschließlich der EMA/FDA-Zulassung, angegeben. Diese Optionen bilden die Grundlage für die Diskussion in einem molekularen Tumorboard (MTB). Im Anhang des medizinischen Berichts stellen wir eine umfangreiche Liste möglicher therapeutischer Strategien für jede identifizierte somatische Veränderung zur Verfügung. Diese Liste enthält neben den Medikamentenklassen und -namen auch deren Zulassung (FDA/EMA) und einschränkende Bedingungen.

Die Grundlage für therapeutische Entscheidungen über Immuntherapien mit Checkpoint-Inhibitoren

Die Tumormutationslast (TMB), also die die Anzahl der somatischen Mutationen pro Megabase (Mut/Mb), ist ein zuverlässiger Biomarker für das Ansprechen auf eine Behandlung mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren.

Je höher die Anzahl der genetischen Variationen innerhalb einer Tumorzelle ist, desto mehr mutierte Proteine werden exprimiert. Diese mutierten Proteine werden zu kurzen Fragmenten (Peptiden) verarbeitet, die auf der Zelloberfläche von Tumorzellen präsentiert werden. Solche mutierten Peptide werden als Neoantigene bezeichnet und sind hoch immunogen. Das bedeutet, dass sie von Immunzellen, insbesondere von T-Zellen, sehr effektiv erkannt werden. T-Zellen sind in der Lage, Tumorzellen nach der Antigenerkennung direkt zu eliminieren. Je höher die Zahl der Mutationen ist, desto größer ist daher die Chance, dass Neoantigene auf Tumorzellen präsentiert werden, und desto effizienter ist die Tumorbekämpfung durch T-Zellen.

Durch Sequenzierung der Gene unseres Panels mit hoher Sensitivität sind wir in der Lage, den TMB zu berechnen. Diese Metrik wird verwendet, um Tumoren in Gruppen mit niedriger und hoher Mutationslast zu klassifizieren. Wir führen die Klassifikation der TMB sowie die genaue Mutationsrate der Tumorprobe auf. Bei der Berechnung der TMB ist die Größe des Panels entscheidend für die Präzision der Ergebnisse. Mit einer Größe von 2,2 Mb liegt CancerPrecision® deutlich über der Mindestanforderung von 1,5 Mb und gewährleistet eine robuste Berechnung der TMB. (Buchhalter et al., 2019)

Die MSI (Mikrosatelliteninstabilität) ist ein weiterer wichtiger Parameter für das Ansprechen auf Immun-Checkpoint-Inhibitoren. Mikrosatelliten sind kleine repetitive DNA-Sequenzen, die sich im gesamten Genom befinden. Die Größe von Mikrosatelliten kann sich aufgrund von Ausfällen der DNA-Mismatch-Reparaturmechanismen verändern. Traditionell wird die MSI durch einen Vergleich von Satellitenregionen in Tumor- und Normalgewebe mittels PCR nachgewiesen. Wir bei CeGaT sagen den MSI-Status mittels NGS vorher. Diese Technik wurde mit Hunderten von Probenpaaren aus Normal- und Tumorgewebe verschiedener Tumorarten validiert, bei denen mehr als 2.500 Mikrosatelliten-Foci getestet wurden.

Verschiedene DNA-Reperaturmechanismen sorgen in gesunden Zellen für ein stabiles und fehlerfreies Genom. Die homologe Rekombination (HR) ist hierbei für die Reparatur von DNA-Schäden, die beide DNA-Stränge betreffen (Doppelstrangbrüche), von besonderer Wichtigkeit. Ist dieser Mechanismus gestört sammeln sich Mutationen, Chromosomenaberrationen und andere Fehler im Genom an und man spricht von einer homologen Rekombinationsdefizenz (HRD). Durch die daraus resultierende genomische Instabilität begünstigt die HRD die Tumorentwicklung und trägt nachweislich zur Tumorentstehung bei verschiedenen Krebsarten, insbesondere bei Brust- und Eierstockkrebs, bei (Heeke et al., 2018; Nguyen et al., 2020). Für zahlreiche HR-defiziente Tumore gibt es wirksame therapeutische Ansätze, die sich die sog. synthetische Letalität infolge der HRD zunutze machen, beispielsweise durch Verabreichung von PARP-Inhibitoren und platinhaltigen Chemotherapien. Diese Therapeutika verursachen DNA-Brüche, die die verbleibende DNA-Reparaturmaschinerie von HR-defizienten Tumoren so stark belasten, dass diese absterben, während gesunde Zellen dank intakter Reperaturmechanismen überleben. Zur Identifizierung der Tumore, bei denen diese Medikamente eingesetzt werden können, ist eine zuverlässige Bestimmung des HRD-Status von höchster Relevanz.

HR-defiziente Tumoren werden häufig durch Keimbahn- oder somatische Mutationen in BRCA1 oder BRCA2 verursacht. Darüber hinaus haben sich Mutationen in anderen HR-Genen wie RAD51C, ATM und PALB2 als mögliche Ursache für eine HRD erwiesen. Allerdings muss nicht jeder genetische Defekt in HR-Genen zwangsläufig zu einer HRD im Tumor führen. Zudem kann eine HRD auch dann vorliegen, wenn keine HR-Genmutation durch Sequenzierung nachweisbar ist (z. B. wurde eine Promotor-Methylierung von BRCAness-Genen ebenfalls als Ursache für eine HRD identifiziert). Werden ausschließlich Sequenz-Mutationen in BRCAness-Genen untersucht, kann eine potenzielle HRD unentdeckt bleiben. Um sicherzustellen, dass HR-defiziente Tumoren nicht übersehen werden, berechnen wir den HRD-Score als Teil jeder CancerPrecision®-Analyse – unabhängig von der Tumorentität.

Der HRD-Score misst eine spezielle Signatur der genomische Instabilität anhand der Anzahl der Chromosomenveränderungen wie Insertionen, Deletionen und Substitutionen, die auf genomweiter Ebene auftreten, auch ohne, dass die dafür verantwortlichen Genmutationen identifiziert werden müssen. Dieses Muster wird anschließend zur Berechnung des HRD-Scores der Tumorprobe verwendet. Der HRD-Score wird aus drei typischen HRD-Ereignissen berechnet:

• Loss of Heterozygosity (LOH)
• Telomeric Allelic Imbalance (TAI)
• Large-scale State Transition (LST)

Der LOH ist der irreversible Verlust eines elterlichen Allels. LOH-Regionen werden definiert als Regionen, die größer als 15 Mb, aber kleiner als das gesamte Chromosom sind. Zur Bestimmung der LST wird die Anzahl der Bruchpunkte zwischen benachbarten Chromosomenregionen herangezogen, die Kopienzahlgewinne oder -verluste von mehr als 10 Mb umfassen. Eine TAI tritt auf, wenn das Telomer eines Chromosoms in einem der beiden Chromosomen stark verkürzt ist, wodurch ein allelisches Ungleichgewicht in dieser Region entsteht. Dieses Ungleichgewicht resultiert daraus, dass die repetitiven DNA-Sequenzen in Telomerregionen besonders anfällig für eine HRD sind.

Bestimmung von Deletionen/Amplifikationen für die höchste therapeutische Ausbeute

Zelluläre Prozesse sind streng reguliert. Diese Regulierung hängt von der korrekten Funktion der Gene ab. Bei Tumoren ist die Kopienzahl der Gene häufig verändert, wodurch die korrekte Funktion der betroffenen Gene beeinträchtigt wird. Eine Erhöhung der Kopienzahl eines Gens kann dessen Aktivität steigern, während eine (teilweise) Deletion zu einem Funktionsverlust führen kann. Daher können Chromosomenaberrationen, die zu Veränderungen der Kopienzahl führen, auch therapeutische Konsequenzen haben.

Bei Tumoren sind Kopienzahlvariationen (CNVs) aufgrund der allgemeinen genomischen Instabilität häufig. Hier sind oft große Chromosomenteile entweder deletiert oder amplifiziert.

Es ist wichtig, diese Deletionen/Amplifikationen zu verstehen und die Gene in der betroffenen Region mit therapeutischer Relevanz zu kennen. Auf der Grundlage der gewonnenen NGS-Daten werden Deletionen und Amplifikationen nachgewiesen.

Zusammen mit den betroffenen Genen mit therapeutischer Relevanz werden die Deletionen und Amplifikationen zu Beginn des Befunds aufgelistet. Ein vollständiges CNV-Profil der analysierten Regionen ist im Anhang des Berichts zu finden.

CNVs spielen in der Tumorgenetik oft eine wichtige Rolle. Die Kenntnis der Veränderungen bei CNVs hilft bei der Wahl der optimalen Behandlung. Die CNV-Analyse ist daher bei uns ein integraler Bestandteil der somatischen Tumordiagnostik.

Identifizierung von Fusionstranskripten – nichts, was Sie bei Ihren Patientinnen und Patienten übersehen wollen

Chromosomale Veränderungen treten häufig bei allen Tumorentitäten auf. Infolgedessen kann es zu Genfusionen im Tumorgenom kommen. Fusionen sind oftmals starke Treiber der Tumorerkrankung und daher für Behandlungsentscheidungen von größter Bedeutung. Herkömmliche, auf PCR-Technik basierende Methoden, können eine Fusion nicht nachweisen, wenn der Fusionspartner nicht bekannt ist (bei NTRK-Fusionen häufig relevant). Selbst Analysen des gesamten Transkriptoms sind nicht sensitiv genug, insbesondere wenn der Tumorgehalt niedrig ist. Um alle bekannten und zuvor beschriebenen, sowie neuartige Genfusionen mit einer therapeutischen Option nachzuweisen, haben wir eine gezielte Anreicherung auf RNA-Basis entwickelt. Das Design umfasst mehr als 100 Gene für den Nachweis neuartiger Fusionen, 85 gut beschriebene Fusionen und 5 spezifische Transkript-Varianten. Diese Methode ist den DNA-basierten Methoden und auch Ansätzen auf ganzer RNA-Basis überlegen. Wir empfehlen dringend, die genetische Tumordiagnostik durch RNA-Anreicherung für Fusionen zu ergänzen, um ein möglichst vollständiges Verständnis der Tumorbiologie zu erhalten.