Transkriptom/mRNA-Sequenzierung

Das Transkriptom repräsentiert die Gesamtheit aller in einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimierten, also von DNA in RNA umgeschriebenen, Gene. Die Transkriptom-Sequenzierung (RNA-Sequenzierung, RNA-Seq) erlaubt daher den Nachweis und die Quantifizierung aller exprimierten RNA-Moleküle in einer biologischen Probe. Dabei besteht die Möglichkeit gezielt die mRNA-Moleküle anzureichern und zu sequenzieren oder die tatsächliche Gesamtheit der RNA exklusive rRNA und tRNA. Die Zielsetzungen für eine Transkriptom-Sequenzierung sind sehr vielfältig und reichen von der Analyse der differentiellen Genexpression über den Nachweis alternativen Splicings bis hin zur Detektion neuer Transkripte. Daher finden Transkriptom-Sequenzierungen ein breites Anwendungsspektrum und werden sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten klinischen Forschung eingesetzt.

Im Bereich der Transkriptom-Sequenzierung führt CeGaT für Sie mRNA-Sequenzierungen durch und bietet Ihnen von der RNA-Extraktion bis hin zur Datenanalyse einen umfassenden Service.

Das Protokoll kann dabei spezifisch an die gewünschte Anwendung und die Voraussetzungen Ihrer Proben angepasst werden. So kann die Zahl und Länge der sequenzierten Reads kundenspezifisch angepasst werden. Auf Anfrage bieten wir für gering konzentrierte Proben außerdem ein Low-Input-Protokoll an, bei dem bereits die Einsendung von 1 ng RNA ausreichend zur Durchführung einer mRNA-Sequenzierung ist.

Starten Sie Ihr Projekt jetzt

Sprechen Sie uns an, wir entwickeln auch für Ihr Projekt gern ein Konzept.

Gegebenenfalls können Sie uns bereits Informationen zum Probenmaterial, der Probenanzahl und der gewünschten Sequenziertiefe geben.

2 + 6 = ?

Bei der Durchführung Ihres Sequenzierauftrages stehen für uns die hohe Qualität und Zuverlässigkeit der gelieferten Ergebnisse im Vordergrund. Jedes Projekt wird durch einen wissenschaftlichen Projektmanager betreut, der während der gesamten Projektphase Ihr Ansprechpartner ist. Bei Projektabschluss erhalten Sie einen detaillierten Projektbericht mit Informationen zur Eingangs-QC, wichtigen Laborparametern und bioinformatischen Auswertungen und Erklärungen.

Technische Informationen

Technische Durchführung

Die Erstellung der Sequenzierbibliothek für Proben mit ausreichender Materialmenge erfolgt mit dem Illumina® TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit. Die Verwendung dieses Kits ermöglicht eine umfassende Analyse der in der Probe vorhandenen mRNA und liefert zugleich Informationen über die Strangorientierung der detektierten Transkripte.

Die anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung der Sequenzierbibliothek wird auf der HiSeq Plattform von Illumina durchgeführt.

Unsere Standard-Sequenziertiefe beträgt 30 M Reads pro Probe. Diese kann jedoch individuell an Kundenwünsche angepasst werden.

Abhängig von der Zielsetzung der Transkriptom-Sequenzierung empfehlen wir unterschiedliche Sequenziermodi: 50 bp single end oder 100 bp paired end. Die untenstehende Tabelle verdeutlicht die von uns angebotenen Kombinationsmöglichkeiten und zeigt beispielhaft Anwendungen auf:

30 M Reads Kundenspezifische Readanzahl
50 bp single end Differentielle Genexpression, Nachweis von durchschnittlich exprimierten Transkripten. Je nach Wahl der Readanzahl Erhöhung oder Erniedrigung der nachgewiesenen Transkripte. Höhere Readanzahlen sind z.B. sinnvoll zum Nachweis schwach exprimierter Transkripte oder zum Nachweis von Gewebemosaiken wie sie in Tumoren zu finden sind.
100 bp paired end Nachweis von alternativem Splicing Je nach Wahl der Readanzahl Erhöhung oder Erniedrigung der nachgewiesenen Transkripte
Tabelle 1: Angebotene Kombinationsmöglichkeiten zur Transkriptom-Sequenzierung und beispielhafte Anwendungen
Bioinformatik

Für die Auswertung der Transkriptom-Daten können Sie zwischen verschiedenen Auswertelevels wählen.

Falls gewünscht bereiten wir Ihnen die Sequenzierdaten so auf, dass Sie direkt mit der funktionellen Auswertung Ihrer Daten beginnen können. Dies beinhaltet beispielsweise die Berechnung von Expressionswerten und der differentiellen Expression aus experimentellen Gruppen, wodurch Sie Informationen zu Expressionswerten, hoch- und herunterregulierten Genen und eine Angabe zu Expressionsunterschieden („fold change“) erhalten. Sollten Sie darüber hinausgehende Analysen selbst durchführen wollen, stehen Ihnen für jeden Zwischenschritt der Analyse ebenfalls Daten zur Verfügung (Rohdaten, alignierte Reads). Bitte beachten Sie, dass für die Berechnung statistisch signifikanter Veränderungen eine ausreichende Zahl von Replikaten pro experimenteller Gruppe notwendig ist.

Falls Sie die vollständige Auswertung entsprechend Ihrer Vorstellungen selbst durchführen wollen, besteht natürlich auch die Möglichkeit, lediglich die Rohdaten der Sequenzen (FastQ-Format, demultiplexed, Adapter getrimmt) zu erhalten.

Auf Anfrage führen wir in spezifischen Fällen auch weiterführende Analysen wie De-novo-Transkriptom-Assembly, Variant Calling und Annotation von Variantenlisten durch.

Lieferumfang

Unser Lieferumfang umfasst folgende Leistungen, die jeweils stufenweise hinzugebucht werden können:

  • RAW: Rohdaten im FastQ-Format (*fastq.gz)
    Möglich für sämtliche Spezies
    Sie erhalten die Sequenzdaten, wie sie vom Sequenzer geliefert werden. Technische Adaptersequenzen haben wir bereits für Sie entfernt.
  • MAP: Alignierte Reads im BAM-Format (*bam)
    Möglich für Mensch, Maus, Ratte und C.elegans
    Die Reads werden mit STAR gegen das Genom der analysierten Spezies aligniert.
  • DE: Expressionswerte und Angaben zur differentiellen Genexpression (*tsv)
    Möglich für Mensch, Maus, Ratte und C.elegans
    Sie erhalten eine Tabelle mit Expressionswerten sowie Tabellen mit hoch- bzw. herunterregulierten Genen (Fold-Change, pValue, qValue) zwischen allen Paaren für, von Ihnen definierten, experimentellen Gruppen. Bitte beachten Sie, dass für die Berechnung der statistischen Signifikanz ausreichend viele Replikate pro experimenteller Gruppe analysiert werden müssen. Gerne beraten wir Sie diesbezüglich. Außerdem erhalten Sie einen Bericht über die Top 10 der differentiell exprimierten Gene und die Top 10 der exprimierten Gene. Um eine erste Einschätzung der Ähnlichkeiten der Expressionsprofile zwischen Ihren Proben zu ermöglichen, führen wir eine hierarchische Clustering-Analyse durch, deren Ergebnis Sie als Abbildung ebenfalls erhalten.
  • Detaillierter Projektbericht (für alle Auswertestufen)
    Unser Projektbericht enthält Informationen zu den Ergebnissen der Qualitätsprüfungen beim Probeneingang, zu den im Labor verwendeten Kits und Protokollen, sowie zu Programmversionen in der Datenprozessierung.
Probenanforderungen

RNA: mindestens 1 µg für das Standardprotokoll, mindestens 1 ng (bei einer Konzentration >50 pg/µl) für das Low Input Protokoll, RIN ≥ 8.0. Der Versand der RNA muss auf Trockeneis erfolgen.

Zellen oder Gewebe: mindestens 25 mm3 oder 5×105 Zellen für das Standardprotokoll, mindestens 200 Zellen für das Low Input Protokoll. Gewebe und Zellpellets sollten in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und auf Trockeneis verschickt werden. Alternativ besteht die Möglichkeit, Zellen oder Gewebe in „RNA later“ (von verschiedenen Anbietern erhältlich) zu stabilisieren und bei Raumtemperatur zu verschicken.

Weitere Informationen

Datenversand: Der Versand der Daten erfolgt auf Festplatte per Post.

Bearbeitungszeit: 6-8 Wochen

Probenaufbewahrung: Die verbleibende RNA wird für 3 Monate nach Datenübergabe aufbewahrt.