Next-Generation Sequencing

Die Einführung von Next-Generation Sequencing (NGS) hat den Blickwinkel auf wissenschaftliche und diagnostische Fragestellungen grundlegend geändert. Die Möglichkeit mittels Next-Generation Sequencing große Mengen Sequenzdaten zu einem vergleichsweise geringen Preis zu produzieren führte zu einer Reihe bahnbrechender Entdeckungen und läutete eine neue Ära im Bereich der Genomforschung ein.

NGS Service

Seit der Gründung ist CeGaT auf die Anwendung von Next-Generation Sequencing (NGS) spezialisiert und bietet daher neben der Diagnostik auch Next-Generation Sequencing als Service für kundenspezifische Projekte an.

Abhängig von der Fragestellung kann unser Labor Sequenzierungen auf verschiedenen HiSeq Plattformen und einem MiSeq (beides von Illumina) anbieten.

Unser Portfolio umfasst:

  • Genom Sequenzierung

  • Targeted Sequencing (Exom und Panels: Agilent SureSelect; Amplikons)

  • Restriction site associated DNA Sequencing (RAD genotyping)

  • RNA Sequenzierung (Transkriptom Sequenzierung, Small RNA Sequenzierung)

  • Metagenom Sequenzierung

Starten Sie Ihr Projekt jetzt

Sprechen Sie uns an, wir entwickeln auch für Ihr Projekt gern ein Konzept.

2 + 5 = ?

Dabei kann unser Team neben fundierten Erfahrungen mit humanen oder anderen Säuger-Proben auch eine weitreichende Expertise in der Bearbeitung von Pflanzen-Proben vorweisen.

Während unserer langjährigen Next-Generation Sequencing Arbeit haben wir eine hohe Kompetenz in Hochdurchsatzverfahren zur Bearbeitung hunderter von Proben entwickelt.
Unsere Labore sind mit fünf Liquid Handling Workstations der Plattformen Agilent Bravo A/B und Hamilton Star ausgestattet. Jede dieser Plattformen können individuell programmiert werden; dies ermöglicht eine spezifische Anpassung unserer Protokolle an Ihre Anforderungen.

In unserem Labor haben wir ein Multiplex-Verfahren etabliert, welches die Sequenzierung von Tausenden von Proben in einem Sequenzierlauf, oder sogar in einer Lane, zulässt und somit ein wirkliches High-Throughput Sequencing ermöglicht.

Gern demonstrieren wir die Machbarkeit Ihrer Hochdurchsatz-Projekte in einer Pilot-Studie.

Unser engagiertes Customer Solutions-Team aus Wissenschaftlern und Bioinformatikern entwickelt in enger Abstimmung mit Ihnen die beste Strategie zur Realisierung Ihrer Projekte.
Dabei bieten wir Ihnen neben der Präparation und Sequenzierung der Proben, die Rohdaten zur Eigenanalyse oder auch eine fertige Auswertung an.

Jedes Projekt wird von einem Wissenschaftler geleitet und von einem Projektmanager betreut, der während der gesamten Projektphase Ihr Ansprechpartner ist.

NGS Technologie

Unter dem Begriff Next-Generation Sequencing (NGS) werden alle innovativen Technologien zur Hochdurchsatz-Sequenzierung zusammengefasst. Next-Generation Sequencing beruht auf der parallelen Sequenzierung von Millionen von unterschiedlichen DNA-Fragmenten in einem einzigen Sequenzierlauf. Im Vergleich mit der klassischen Sanger-Sequenzierung ermöglicht diese neue Technologie eine Steigerung des Durchsatzes um mehrere Größenordnungen bei gleichzeitig drastischer Reduzierung der Kosten.

Die einzelnen Schritte auf dem Weg von der DNA zur Sequenz lassen sich in drei Abschnitte gliedern: (1) Herstellung einer DNA-Bibliothek. (2) Klonale, parallele Amplifikation der DNA. (3) Sequenzierung.

Herstellung der DNA-Bibliothek

Zur Herstellung der DNA-Bibliothek wird die DNA zuerst fragmentiert. Im Anschluss müssen die Enden der DNA-Fragmente repariert werden, da diese durch die Fragmentierung „ausgefranst“ sind. Die Ligation von Adaptern an beide Seiten der reparierten DNA-Fragmente schließt die Herstellung der DNA-Bibliothek ab. Diese Adapter enthalten Sequenzmotive, die für die weiteren Schritte (Klonale Amplifikation und die eigentliche Sequenzierung) notwendig sind.

Klonale Amplifikation

Die Technologie von Illumina® verwendet zur klonalen Amplifikation der einzelnen Fragmente der DNA-Bibliothek die sogenannte Bridge-PCR. Diese besondere PCR erfolgt auf der Flow Cell (Glass Slide ähnlich einem Objektträger) auf der dann auch die eigentliche Sequenzierung stattfindet. Die DNA-Fragmente werden hierfür über die Adapter an die Flow Cell gebunden, dann erfolgt die Bridge-PCR, bei der die auf der Flow Cell gebundenen Oligos als Primer fungieren. Pro DNA-Fragment entstehen durch diese Art der Amplifikation einzelne, von einander getrennte Cluster klonaler DNA-Fragmente.

Sequenzierung

Die Sequencing-by-Synthesis (SBS) Methode von Illumina® bedient sich der Cyclic Reversible Termination (CRT). Alle vier Nukleotide sind mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt und durch eine Terminatorgruppe modifiziert. Während eines Reaktionszyklus werden der Polymerase gleichzeitig alle vier Nukleotide zur Strangsynthese angeboten. Nach Einbau eines komplementären Nukleotids ist eine Strangverlängerung durch die blockierende Wirkung der Terminatorgruppe nicht mehr möglich. Die vier Farbstoffe jedes Nukleotids werden mittels Imaging detektiert; die Farbstoffe und die Terminatorgruppe werden abgespalten; ein neuer Synthesezyklus beginnt. So wird Base für Base die Sequenz eines jeden Clusters auf der Flow Cell gleichzeitig ermittelt.

Computergestützt werden dann die einzelnen Basen-Sequenzen (Reads) zusammengesetzt und mit dem Referenzgenom abgeglichen.